2017中西医助理医师_药理学章节解析：第三章有机磷酸酯类中毒与解救_第2页

　　【目的和原理】学习 AChE活性的测定方法 ,观察中毒前后及使用不同解救药后 AChE活性的变化。

　　ACh在血液中被 AChE水解，产生醋酸和胆碱。在一定范围，水解的 ACh量与 AChE的活性成正比。故在反应体系中，加入定量的 ACh使之参加反应，通过测定剩余的 ACh即可计算出水解 ACh的量，从而推算出 AChE活性。

　　ACh的呈色反应

　　ACh可与羟胺反应生成乙酰羟肟酸，后者在酸性条件下与三价铁离子形成褐色的羟肟酸铁络合物，其颜色的深浅可反映 ACh含量。反应过程如下：

　　(1)盐酸羟胺与氢氧化钠作用释放出游离羟胺

　　NH2OH·HCL+NaOH→NH2OH+NaCL+H2O

　　(2) 剩余 ACh与游离羟胺作用，生成羟肟酸化合物

　　(CH3)≡N—(CH2)2OCOCH3+NH2OH→CH3CONHOH +(CH3)3≡N—(CH2)2OH

　　(3)羟肟酸化合物在酸性环境中与三氯化铁生成褐色复合物(羟肟酸铁络合物)

　　酸性 Fe/3

　　FeCL3+CH3CONHOH

　　CH3CONHO+HCL

　　(棕红色)

　　【实验药品】

　　(1) 7×10-3mol/L氯化 ACh：取 ACh用蒸馏水配成 2.54%溶液，冰箱保存。用前以蒸馏水 20倍稀释即成 7×10-3mol/L ACh溶液。

　　(2) 1mol/L盐酸羟胺( NH2OH·HCL)：取 25g盐酸羟胺，加蒸馏水 359ml，冰箱保存。

　　(3) 3.5N NaOH。

　　(4) 4N HCL。

　　(5) 3.7×10-1mol/L三氯化铁(FeCL3·6 H2O )：取 10g三氯化铁，加蒸馏水至 20ml，浓 HCl 0.84ml，加温溶解，最后加蒸馏水至 100ml制成 3.7×10-1mol/L三氯化铁(FeCL3 0.1N HCl)溶液。

　　(6) PH7.2的磷酸缓冲液：取Na2HPO4·12H2O16.72g和KH2PO42.72g加蒸馏水至100ml，冰箱保存。

　　【实验步骤】

　　(1)家兔在给药前、中毒症状明显后、给atropine待症状明显缓解后、给予 PAM解救后0min、10min、20min、30min等时间点分别由兔耳缘静脉或股静脉取血0.5ml，测定 AChE活性。

　　(2)取 20ml试管若干个，按表加入磷酸缓冲液 0.85~1ml，血样 0~0.15ml，置 37℃±1℃恒温水浴中预热 3~5min。

　　(3)加入 7×10-3mol/L ACh溶液 1.0ml(用加样器)，于 37℃±1℃水浴中反应 40min，每隔 10min摇动一次。

　　(4)反应 40min后立即加入碱性羟胺( 1mol/L NH2OH·HCL与 3.5N NaOH溶液在用前20min等容混合，并不断震荡)4.0ml。

　　(5)依次加入 4N HCL和 3.7×10-1mol/L FeCL3各 2ml，每加入一种试剂都要充分振荡。

　　(6)上述反应液均用滤纸过滤，将滤液倒入比色杯中，以 530nm的波长比色。

　　(7)对照管(标准 ACh值)：为反应体系中全量 ACh对照。

　　空白管：为无血、无 Ach的其它试剂对照。

　　对照管与空白管操作步骤同其它样品。

　　【实验结果】

　　1.计算酶活性：全血 AChE活性值以 0.15ml全血在 40min内水解 ACh的μmol数表示

　　(μmol/0.15ml/40min)

　　①酶活性计算：

　　OD标准管—OD测定管

　　全血 AChE活性值 = ×7

　　OD标准管

　　②酶活性值百分数计算

　　样本 AChE活性值

　　×100%

　　正常全血 AChE活性值

　　1.绘制时效曲线

　　根据给予 PAM解救后几个时间点的 AChE活性值制图。

　　酶活性(%)

　　时间

　　【注意事项】

　　1.Depterex属于剧毒杀虫剂，且可从皮肤吸收，如与手等接触后，应立即用清水清洗。

　　2.给家兔 depterex后，15min仍未出现中毒症状，可再追加 1/3剂量的depterex溶液。

　　3.测定 AChE活性时，加入每种试剂时剂量一定要准确。